石油及其制品在生产、加工、运输和使用过程中产生的大量石油污染物进入环境，对土壤造成了严重污染，因此对石油污染土壤的治理已迫在眉睫。石油污染土壤治理技术中，与物理修复、化学修复技术相比，微生物修复技术因其修复效果好、操作简便、费用低、降解过程迅速和无二次污染等特点，被广泛采用。微生物修复技术的本质是通过微生物的代谢活动将污染物降解，修复过程所用的微生物多为土著微生物；若要提高修复效果，还需引入驯化的高效石油降解菌。

　　相比于正交设计，均匀设计的主要优势是：在因素和水平数均较多的情况下，用较少的实验次数就可获得期望的结果，节省人力和物力，便于实施。目前，国内还少见将均匀设计法用于石油污染土壤微生物修复技术的研究报道。本工作采用从东营石油污染土壤中富集、分离出的4种高效石油降解菌，对模拟石油污染土壤进行微生物修复。在单菌种使用效果不理想的情况下，研究了多种高效石油降解菌混合使用的效果，确定了各菌的最佳配比及菌群的最优培养条件，并进一步从理化性质、酶活性和微生物种群数量方面比较了土壤经微生物修复前后的变化，为东营石油污染土壤微生物修复的现场应用提供了技术参考和理论支持。

　　1、实验部分

　　1.1 材料、试剂和仪器

　　原油：山东省东营市某炼油厂；土壤：山东省东营市东营未受污染的浅层（5~25cm）土壤。土壤经破碎、除杂、混匀、筛分后，按原油与土壤质量比为1∶20混合均匀，制成模拟石油污染土壤（模拟土样），并将其密封储存在灭菌牛皮纸袋内冷藏备用。

　　LB培养基：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂15g/L；菌种（包括根瘤菌（A）、节细菌（B）、嗜盐菌（C）和芽孢杆菌（D））：实验室保藏；表面活性剂：主要成分为槐糖脂。

　　PHS-3型酸度计：上海精密科学仪器有限公司；

　　721型可见光分光光度计：北京光学仪器厂。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1  4种单菌与土著微生物石油降解率的比较

　　采用LB培养基保藏4种单菌。将模拟土样按每份50g分别装入80个锥形瓶中，并将锥形瓶分成5组，每组16个。取其中4组分别以50.0mL/kg的接种量加入A，B，C，D菌悬液，置于28℃恒温箱中。剩余1组未加菌种，作为对照样考察土著微生物的修复作用。每间隔一段时间取样，采用重量法测定土壤试样中石油的含量，计算石油降解率。

　　1.2.2 优势菌群的构建和最佳配比的确定

　　对4种菌进行2种、3种、4种的组合，分别将不同组合的混合菌按一定的接种量加入到模拟土样中，每组加入的混合菌菌悬液的总接种量均为50.0mL/kg，各加入菌的接种量分别相等。在28℃的恒温箱中放置40d后，测定土壤试样中石油的含量，计算石油降解率，从而构建出优势菌群。采用均匀设计法对优势菌群的配比进行优化。

　　1.2.3 培养条件优化实验选取

　　5个影响石油降解率的代表性因素：混合菌接种量、土壤含水率、鸡粪加入量、麦糠加入量和表面活性剂加入量，并将其控制在不同水平，采取均匀设计考察各因素对修复效果的影响。按确定的最佳配比将4种菌接种到石油污染土壤中，在28℃的恒温箱中放置40d后，测定土壤试样中石油的含量，计算石油降解率。

　　1.3 分析方法

　　1.3.1 土壤理化性质测定方法

　　采用电位法测定土样pH，水与土的体积比为2.5；重铬酸钾容量法测定模拟土样的有机质含量；半微量凯氏法测定模拟土样的总氮含量；钼锑抗比色法测定模拟土样的总磷含量。